330: Больше микробиологии ротовой полости

В этом выпуске TWiM рассматриваются вопросы инженерии бактерии _E. coli_ с единственным стоп-кодоном и механизмы адгезии бактерий в зубном налете. В дискуссии принимают участие эксперты в области микробиологии и смежных дисциплин.

Я хотел бы обсудить статью из журнала Nature под названием "Engineering a Genomically Recoded Organism with One Stop Codon". Это очень крутая, но и довольно сложная работа, отчасти потому, что в ней предполагается наличие у читателя большого объема предварительных знаний. Статья посвящена созданию новой бактерии под названием ochre, которая была сконструирована так, чтобы использовать только один стоп-кодон.

Генетический код состоит из 64 кодонов, кодирующих 20 аминокислот, а также включает стоп-кодоны для прекращения трансляции. Это означает, что некоторые аминокислоты кодируются более чем одним кодоном, что отражает вырожденность кода. Существует три стоп-кодона: UAA, UAG и UGA, которые имеют старые названия: охра, янтарь и опал.

Ранее был создан штамм _E. coli_, в котором все стоп-кодоны TAG были заменены кодонами TAA. Это включало удаление гена RF1, который распознает кодон TAG, освобождая его для переназначения для кодирования другой аминокислоты, если это необходимо. Исследователи называют это высвобождением кодона для переназначения.

Цель состоит в том, чтобы удалить другие стоп-кодоны и получить организм только с одним стоп-кодоном. Это позволит использовать два других для создания необычных белков. Речь идет об изучении возможностей манипулирования генетическим кодом для синтетической биологии.

Они стремятся сжать избыточную функциональность кодона в один кодон, создав организм ochre только с UAA в качестве стоп-кодона. Это основано на идее, что наличие трех стоп-кодонов несколько избыточно. Процесс включает в себя несколько сложных этапов.

Отправной точкой является штамм _E. coli_, в котором все кодоны TAG уже удалены. Это хорошее начало для достижения их цели. В простой _E. coli_ насчитывается почти 1200 TGA.

Возникает вопрос о том, что происходит с селеноцистеином, аминокислотой, используемой в важном ферменте в _E. coli_, формиатдегидрогеназе. Михаэль Шмидт поднимает этот вопрос, потому что многие ферменты, использующие селен, полагаются на опаловый кодон для вставки селеноцистеина. Поскольку его неэффективно вставлять, селеноцистеин есть не во всех аминокислотах. Они оставили эти гены в покое, не меняя стоп-кодон.

Они используют процесс, называемый MAGE (Multiplex Automated Genome Engineering), для выполнения крупного мутагенеза, внося тысячи изменений за раз. Этот подход, разработанный Джорджем Черчем, позволяет проводить масштабные модификации. Это отражает тенденцию к высокопроизводительным методам в молекулярной биологии.

В процессе MAGE в бактериях накапливается около 700 непреднамеренных фоновых мутаций. Хотя это и не удивительно, учитывая масштабы мутагенеза, это то, чем необходимо управлять. Они уделяют приоритетное внимание приспособленности, отбирая самые быстрорастущие штаммы для следующих этапов, не секвенируя все мутации.

Факторы высвобождения и мутации

Терминационные факторы высвобождения, RF1 и RF2, распознают стоп-кодоны и вызывают высвобождение пептида и прекращение трансляции. Эти факторы высвобождения по своей структуре напоминают тРНК. RF1 терминирует UAG и UAA, а RF2 терминирует UGA и UAA, демонстрируя некоторое перекрытие.

RF1 уже удален, но RF2 имеет другие функции, помимо терминации, что делает его необходимым. Они не могут просто удалить его, потому что он участвует в других критических процессах. Они идентифицируют мутации в RF2, которые позволяют ему выполнять свои другие функции, но ослабляют его терминацию в UGA.

Они стремятся ослабить распознавание UGA, чтобы уменьшить конкуренцию с любой аминокислотой, которую они хотят вставить в этот кодон. Если UGA присутствует, фактор будет продолжать распознавать его и конкурировать с желаемой аминокислотой. Они проводят обширный мутагенез, используя структурное предсказание с помощью AlphaFold для выявления потенциальных изменений аминокислот.

Они идентифицируют конкретное изменение аминокислоты, R170K, которое избирательно ухудшает распознавание стоп-кодона, но не другие функции. Они хотят двигаться вперед с этим конкретным изменением. Анализы показывают 42-кратное усиление считывания в мутанте, где RF2 был изменен, по сравнению с отсутствием супрессоров.

Они используют флуоресцентный репортер с зеленым и желтым флуоресцентными белками, разделенными стоп-кодоном, для количественной оценки считывания. Это позволяет им измерять количество красного и зеленого, указывая на эффективность трансляции через стоп-кодон. Это умный способ визуально оценить, насколько хорошо рибосома считывает стоп-кодон.

Точная настройка и применение

Штамм подвергается масс-спектрометрии, выявляющей большое количество подавления триптофана, когда тРНК триптофана считывает кодон UGA. Чтобы предотвратить конкуренцию с тРНК триптофана, они модифицируют ген тРНК, чтобы отменить распознавание UGA. Речь идет не только об уничтожении стоп-кодона.

При такой модификации UGA теперь свободен для переназначения, но штамм демонстрирует плохую приспособленность, время удвоения сокращается на 50%. Изменение RF2 в значительной степени ответственно за это, что требует дальнейшей настройки для улучшения роста для применения в инженерии. Они хотят научиться настраивать эти факторы.

Они конструируют флуоресцентные репортерные плазмиды для вставки флуоресцентных молекул в два стоп-кодона. Это позволяет измерять включение различных аминокислот в эти переназначенные стоп-кодоны. Это помогает оценить точность и эффективность переназначения.

Процесс включает в себя не только изготовление тРНК, связанной с этими молекулами, но и модификацию тРНК-синтетазы. Синтетаза - это фермент, ответственный за связывание химических веществ с тРНК. Происходит много всего, чтобы это заработало.

Эксперимент работает, позволяя им вставлять различные аминокислоты в оба переназначенных стоп-кодона. Больше нет конкуренции с супрессорными тРНК. Они могут помещать аминокислоту, различные аминокислоты в оба этих стоп-кодона, которые они переназначили.

Теперь у них есть штамм ochre, в котором все геномные стоп-кодоны заменены на TAA. TGA и другой стоп-кодон заменены на TAA, и они сконструировали тРНК триптофана и RF2. Нестандартные аминокислоты включаются с точностью более 99%.

Зубной налет и образование биопленки

Переключаясь, я погружаюсь в рот вместе с Михаэлем Шмидтом, чтобы обсудить зубной налет. Я буду обсуждать статью под названием Identification of Vianella parvula and Streptococcus gordoni adhesions, mediating coaggregation and its impact on the physiology and mixed biofilm structure. Обсуждение вызвано аккредитацией стоматологических клиник, которая проводится каждые семь-восемь лет из-за COVID.

Зубной налет - это полимикробное сообщество, в котором основную роль играют образование биопленки и коагрегация. Такое поведение, когда один вид бактерий связывается с другим, имеет решающее значение. Это способствует развитию сложного организованного консорциума, который стоматологи знают как налет.

Зубной налет - это полимикробная биопленка. Нарушения в этой биопленке могут ускорить или замедлить развитие кариеса (полостей), чего не хочет ни один ребенок. Накопление налета и зубного камня приводит к гингивиту, легкой форме заболевания десен. Десны становятся красными, опухшими и кровоточат при чистке зубной щеткой или зубной нитью.

Гингивит, если его не корректировать, может прогрессировать до периодонтита, более тяжелой формы заболевания десен со значительным воспалением и резорбцией кости. Это приводит к растворению челюсти и инфицированию зубов. Образуются глубокие карманы, приводящие к рецессии десны.

Периодонтит приводит к образованию глубоких карманов и рецессии десны, в результате чего зубы кажутся длиннее. Это также приводит к галитозу или неприятному запаху изо рта, выходящему за рамки простого запаха чеснока или лука. Этот запах может быть настолько сильным, что может отслаивать краску со стен.

_Vianella parvula_, строго анаэробная бактерия с двумя мембранами, является нормальным компонентом нашей оральной флоры. Несмотря на принадлежность к семейству, которое должно быть грамположительным, она имеет две мембраны, как грамотрицательные бактерии. Она связана с такими заболеваниями, как периодонтит, кариес, остеомиелит и менингит.

_Vianella Parvula_ и биопленка

_Vianella_ является связующим видом, который способствует образованию зубного налета, связываясь с начальными колонизаторами поверхности зуба. Пелликула, белковый слой, который покрывает ваши зубы после чистки, служит защитным слоем эмали. Затем она привлекает ранних и поздних колонизаторов, чтобы помочь сформировать сложную биопленку.

Патогены, такие как _Porphomonas gingivalis_, _Treponema denticola_ и _Tanarella forsythia_, прикрепляются к растущей биопленке. _Porphomonas gingivalis_ ранее была замешана в запуске развития налета в головном мозге, что указывает на раннее начало болезни Альцгеймера. Эти патогены объединяются, образуя то, что известно как комплекс Сагранского.

_Vianella_ следует рассматривать как ключевой экологический вид, необходимый для образования оральной биопленки. Понимание ее роли имеет решающее значение для поддержания здоровья полости рта. Ее рост зависит от лактата, отходов жизнедеятельности стрептококков.

Стрептококки бывают либо гомо-, либо гетероферментативными, производя молочную кислоту, которую потребляет _Vianella_. Это взаимодействие важно, потому что стрептококки являются основателями биопленки во рту. Молочная кислота отвечает за растворение кристаллической решетки гидроксиапатита зубов, что приводит к образованию полостей.

Понимание того, как _Vianella parvula_ коагрегирует, и влияние этой агрегации является давней задачей. Понимание затруднено отсутствием соответствующих генетических инструментов. Исследователи стремятся понять, как поддерживать полезные бактерии без вытеснения вредными.

Адгезия и коагрегация

Исследователи из Института Пастера исследовали это явление коагрегации, используя естественно компетентный штамм _Vianella parvula_, SKV38. Это означает, что они могут проводить генетические исследования на _Vianella parvula_. Ранее они описали девять генов, кодирующих тримерные аутотранспортные адгезины (ТАА).

ТАА - это большие волокнистые гомотримерные белки клеточной поверхности, которые содержат модульный домен. Они облегчают прикрепление к различным поверхностям и опосредуют аутоагрегацию. Это означает, что они могут связываться с различными поверхностями.

Один из этих аутоагрегирующих белков, HAG1, опосредует адгезию к оральным бактериям и буккальным клеткам. Это плоские клетки, которые выстилают внутреннюю часть ваших щек и губ. Они являются отличным источником ДНК.

Девять ТАА названы VTA от A до L, а три классических мономерных аутотранспортера названы VMA от A до C. Как VTA A, так и генный кластер, кодирующий восемь из этих тримерных гомотримерных поверхностных белков, важны для адгезии к поверхности и образования биопленки. Номенклатура немного запутанна, поэтому почти необходимо создать шпаргалку.

VTA-A также опосредует аутоагрегацию _Vianella parvula_, позволяя ей прилипать к себе. Прототипом этого семейства белков является адгезия Yersinia YAD-A, которая связывается с коллагеном и другими белками внеклеточного матрикса. В этом случае VTA Vianella не позволяет ей прилипать к нашим вещам, она просто прилипает к другим бактериям.

Дорсен и коллеги стремились выявить адгезины, опосредующие коагрегацию Vianella и _Streptococcus gordoni_. Они также стремились выяснить, как коагрегация этих микробов влияет на физиологию в этой смешанной структуре биопленки. Это сложное взаимодействие, требующее детального исследования для понимания.

Разрушение зубного налета

Цель состоит в том, чтобы выяснить правильное распределение. Рисунок иллюстрирует сложную историю, поэтому вам нужно следовать теме того, как показать, учитывая генетическую систему, в которой они могут проводить бинарные эксперименты или эксперименты по нокауту. Есть люди, у которых образуется много полостей, а есть люди, у которых их не образуется вообще.

_Vianella parvula_ использует специфические адгезины для взаимодействия со _Streptococcus oralis_, _Gordonia_ и _Actinomyces oris_. Они образуют базовый слой налета, на который накладываются другие микробы. Они провели анализ с отдельными культурами штамма SKV38, выращенными в богатой среде с D-лактатом натрия.

Среда поддерживает in vitro биопленки с разнообразием, аналогичным здоровому поддесневому инокуляту. SKV38 не прилипает к себе, но коагрегирует с несколькими видами _Strep Gordoni_, _Streptococcus oralis_ и одним штаммом _Actinomyces oralis_. Среда позволяет им проводить свои эксперименты.

Он не коагрегировал со _Strep mitis_, _Streptococcus parasanguinis_, _Fusobacterium nucleatum_ или _Strep mutans_. Рисунки предназначены для того, чтобы легко показать, кто к чему прилипает. Чем меньше столбик, тем больше агрегация, что гениально.

Исследования мутантов и совместные культуры

Они определили, какие из 12 адгезинов Vianella участвуют в коагрегации с разными партнерами. Они сконструировали отдельные мутанты с делецией каждого адгезина и провели анализы коагрегации, смешивая независимые культуры. Это позволило им протестировать три штамма.

Они показывают, что VTA также опосредует коагрегацию с oralis, тогда как VTA-A и VTA-E участвуют в коагрегации с actinomyces oris. VTA-E и VTA-D необходимы для коагрегации с gordonis. У них есть буферы агрегации, которые помогают визуализировать их слипание.

Они показывают, что VTA не позволяет ему прилипать к нашим вещам, а только к другим бактериям. С помощью делеции отдельных или множественных генов ТАА Дорсен и его коллеги показывают, что VTA также опосредует коагрегацию с oralis. Это контрастирует с ТАА vianella, который наблюдался с HAG-1, который обычно связан с другим видом vianella.

Исследования делеций показали, что, когда коагрегация предотвращалась посредством делеции VTA в strept gordoni или VTA-DE в vianella, результирующие биопленки в конечном итоге разделялись. Это большой шаг в понимании того, как разрушить зубной налет. Порядок и метаболизм, вероятно, являются движущими силами.

Транскриптомика эффективно подтверждает более ранние эксперименты. Все данные транскриптомики доступны в статье с открытым исходным кодом для дальнейшего изучения. Они закончили моделью, которая предлагает понимание молекулярных детерминант в основе механизмов коагрегации между parvula и различными членами зубного налета.

Последствия и выводы

Они идентифицировали эти три белка _Vianella parvula_ и один новый адгезин strep gordoni, участвующие в этой коагрегации. Их транскриптомные исследования показали влияние такой коагрегации на физиологию партнера и структуру ко-биопленки. Исследователи немного оставляют нас в подвешенном состоянии.

_Vianella_ использует определенные наборы множественных тримерных аутотранспортеров для специфического взаимодействия с другими членами орального зубного налета. Хотя эти адгезивные способности не являются необходимыми, уменьшенное расстояние между членами биопленки с использованием адгезивных молекул.

Поскольку молекулы кворума высвобождаются, вероятность столкнуться, а затем воздействовать на генетический переключатель, вероятно, выше. Концентрация фактора кворума может быть больше или меньше в зависимости от того, кто ворует факторы кворума. Такие явления коагрегации, вероятно, способствуют высокоорганизованному процессу образования зубного налета.

Теория микробных комплексов - это действительно микробиом. Организация бактерий в сообществе и роль отдельных видов в этом сообществе могут повлиять на развитие прогрессирования пародонтита. Диаграмма классифицирует бактерии, помогая понять образование налета и прогрессирование заболевания.

Разработчики зубных паст могут быть заинтересованы в этой работе. Можете ли вы добавить B. parvella, которая уже прикреплена. Выяснение конкретных взаимодействий и того, какие адгезины опосредуют эти взаимодействия, является одним из ключевых шагов в создании биопленки.

В заключение, исследование _E. coli_, сконструированной с единственным стоп-кодоном, ochre, и исследование роли _Vianella parvula_ в образовании зубного налета выявляют потенциальные применения в белковой инженерии и здоровье полости рта, соответственно. Работа подчеркивает сложность микробных взаимодействий, а также проблемы и возможности в манипулировании этими системами для практической пользы.